استخراج پرولین از بافت تر گیاهی

بر طبق مطالعات محققین مختلف تنش­های غیر زنده خصوصاً خشکی و شوری بر روی متابولیسم ازت در گیاهان تأثیر می­گذارد. نتایج تحقیقات پژوهشگران متعدد حاکی از آن است که تحت تنش آبی و در گیاهان پژمرده هیدرولیز پروتئین­ها به وقوع می­پیوندد و این موضوع باعث افزایش آمینواسیدها در گیاه  می­گردد.

وقتی کمبود آب شدید باشد، آمینواسیدهای آزاد به خصوص پرولین در بافت­های گیاه جمع می­شوند. میزان اسیدآمینه پرولین آزاد (که در ساختمان پروتئین شرکت ندارد) در گیاهان تحت تنش به طور قابل ملاحظه­ای افزایش می­یابد.

افزایش پرولین در جهت کاهش پتانسیل آبی گیاه به منظور حفظ فشار آماس صورت می­گیرد. پرولین مانند برخی آمینواسیدهای دیگر،­ اسیدهای­آلی، قندها و ترکیبات آلی دیگر به عنوان یک تنظیم کننده ­اسمزی[1] در تعدیل شرایط اسمزی سلول ایفای نقش کرده و بدین ترتیب اثرات کمبود آب را خنثی می­کند. ثابت شده است که افزایش پرولین در نتیجه سنتز جدید آن است و از تجزیه پروتئین حاصل    نمی­شود.

برای پرولین علاوه بر نقشی که به عنوان تنظیم­کننده اسمزی داراست، اعمال زیر نیز پیشنهاد  شده­اند:

1-    مخزن انرژی برای تنظیم پتانسیل احیای سلولی.

2-    پرولین می تواند مانند یک آنتی اکسیدانت نقش دهنده قوی الکترون  را برای پاکسازی کردن رادیکال­های آزاد ایفا نماید.

3-    محافظت از بزرگ مولکول­هایی مثل پروتئین­ها

4-    کاهش اسیدیته داخل سلول

ذخیره مواد کربنه و ازت­دار برای دوره رفع تنش

[1] Osmoticum

آماده سازی محلول ها:                                           

1.       فسفریک اسید 6 مولار: 12/41 میلی لیتر اسید فسفریک 85% با دانسیته Kg/L 1/68 به آب مقطر افزوده و سپس به حجم 100 میلی لیتر رسانیده شد.

2.       سولفوسالیسیلیک اسید 3%: 3 گرم پودر سولفوسالیسیلیک اسید را در آب مقطر حل نموده و به حجم 100 میلی‌لیتر رسید.

3.       اسید ناین‌هیدرین: مقدار 25/1 گرم پودر اسید ناین‌هیدرین را در 30 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال حل نموده و سپس 20 میلی‌لیتر اسید فسفریک 6 مولار آماده‌شده به آن اضافه گردید.

4.       استاندارد 100 میلی­گرم­در­لیتر پرولین: 0100/0 گرم پرولین را در آب مقطر حل نموده و به حجم 100 میلی‌لیتر رسید.

5.       استانداردهای 0, 4, 8 , 12, 16 و 20 میلی­گرم­در­لیتر پرولین: به ترتیب 0, 2, 4, 6, 8 و 10 میلی لیتر از استاندارد 100 میلی­گرم­در­لیتر پرولین برداشته و با آب مقطر به حجم 50 میلی‌لیتر رسانیده شد.

6. تولوئن.

روش کار:

1.       5/0 گرم ماده تر گیاهی را با هاون خرد شده و درون یک تیوب ریخته شد، سپس 10 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک اسید 3% آماده‌شده را به آن اضافه نموده و نمونه را درون یخ قرار داده شد.

2.       تیوب را در 15000 دور به مدت 10 تا 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ نموده تا مواد اضافی از محلول جدا گردید. می­توان به جای سانتریفیوژ از قیف شیشه­ای و کاغذ صافی برای صاف کردن نمونه ها استفاده کرد.

3.       مقدار 2 میلی‌لیتر از عصاره صاف شده را درون تیوب جدید ریخته و 2 میلی‌لیتر اسید ناین‌هیدرین و 2 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال به آن افزوده و سپس خوب مخلوط شد.

4.       همزمان مقدار 2 میلی‌لیتر از محلول­های استاندارد صفر، 4، 8، 12، 16 و 20 میلی­گرم ­در ­لیتر پرولین را درون تیوب­های جدید ریخته و 2 میلی‌لیتر اسید ناین‌هیدرین و 2 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال به آن­ها افزوده و سپس خوب مخلوط شد.

5.       نمونه‌ها را در حمام آب گرم به مدت 1 ساعت حرارت داده و سپس درون حمام یخ قرار داده شد.

6.       مقدار 4 میلی‌لیتر تولوئن به محلول اضافه نموده و آن را به مدت 20 ثانیه با دستگاه ورتکس به هم زده شد.

استانداردهای پرولین محلول در فاز تولوئن را به اندازه لازم در کووت دستگاه اسپکتروفتومتر ریخته و مقدار پرولین را در طول موج 520 نانومتر قرائت کرده و منحنی استاندارد رسم شد. سپس میزان جذب در نمونه های گیاهی را قرائت نموده و با قراردادن آن در معادله خط مقدار پرولین آمد.

توجه: نمونه‌ها و محلول ناین‌هیدرین را در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

 منابع:

حسیبی، پ.، م. نبی پور و ف. مرادی. 1389. بررسی نقش برخی محافظت کننده های سرمایی در القای تحمل تنش دمای پایین به گیاهچه های برنج. مجله الکترونیک تولید گیاهان زراعی. جلد سوم، شماره اول، بهار 1389. صفحات 39-56

Bates LS, Waldern RP, Tear ID. 1973. Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil. 39:205-207.                             

Kramer, P.J. 1969. Plant and Soil water Relationships: A Modern synthesis. McGraw-Hill, Inc. New York.